НОВЫЙ МЕТОД ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА

Система комплемента является важным компонентом врожденного иммунитета, обеспечивающим первичную защиту против проникающих в организм патогенов. Кроме того, показано, что система комплемента связана со многими заболеваниями, не только аутоиммунными и инфекционными, но и психическими. В связи с этим необходима разработка доступного и быстрого метода определения активности системы комплемента в режиме реального времени. Представлен новый автоматизированный метод оценки функциональной активности системы комплемента (СК), основанный на цитолитическом действии этой системы для инфузорий Tetrahymena pyriformis. Метод состоит в циклическом подсчете живых подвижных клеток с помощью разработанного нами прибора БиоЛаТ, в состав которого входят две видеокамеры, устройства подсветки и перемещения круглого планшета, планшет с двумя рядами лунок, микропроцессорный блок управления. Управляет работой прибора и осуществляет подсчет клеток программа AutoCiliata. Подсчет производится на основе последовательной фиксации двух кадров c дальнейшей программной обработкой изображений. Представлены результаты микроскопических наблюдений процесса гибели клетки в буфере на основе триэтаноламина с 5% концентрацией сыворотки крови, а также результаты сравнения активности СК в различных буферах – среде культивирования инфузорий, веронал-мединаловом буфере и буфере на основе триэтаноламина (ТЭА). Обоснована замена веронал-мединалового буфера на буфер на основе триэтаноламина. Время гибели всех клеток в буфере на основе триэтаноламина с концентрацией сыворотки 5% не превышает 15 минут для всех исследованных сывороток. В качестве величин, характеризующих активность СК, выбраны время гибели половины клеток (ТЛД50) и величина 100 × (1/ТЛД50)% (активность системы комплемента, АСК). Представлены результаты оценки чувствительности метода, на основе зависимостей ТЛД50 и АСК от концентрации сыворотки. Выдвинуто предположение о возможности оценки интегральной активности комплемента и соотношения интенсивностей синтеза и расхода его эффекторных белков. Отражены результаты исследования разного содержания ионов Ca++ и Mg++ в буфере и обоснован выбор их физиологических концентраций,2,5 мМи1,5 мМсоответственно. Оценены статистические характеристики точности аппаратной и методической частей метода, средние коэффициенты вариации составляют 3,9 и 2,7% соответственно, что удовлетворяет требо ваниям надежности результатов исследования, а короткое время исследования доказывает возможность применения метода в клинической практике в онлайн-режиме. Разработан метод полуавтоматического определения функциональной активности сывороточного комплемента, который может быть использован в повседневной клинической практике, том числе в онлайн-режиме. 

1. Кулешина О.Н., Андина С.С., Попова О.П., Черемных Е.Г., Козлов Л.В. Активность комплемента при коклюше // Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2013. T. 2, № 69. С. 46-51. [Kuleshina O.N., Andina S.S., Popova O.P., Cheremnykh E.G., Kozlov, L.V. Activity of complement in pertussis]. Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika = Epidemiology and Vaccination, 2013, Vol. 2, no. 69, pp. 46-51. (In Russ.)]

2. Кулешина О.Н., Козлов Л.В., Черемных Е.Г. Универсальный метод определения функциональной активности комплемента человека, лабораторных, домашних и сельскохозяйственных животных, земноводных и птиц // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2014. T. 157, № 2. C. 254-257. [Kuleshina O.N., Kozlov L.V., Cheremnykh E.G. Universal method for determining the functional activity of the human complement, laboratory, domestic and farm animals, amphibians and birds]. Byulleten eksperimental`noy biologii i meditsiny = Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2014, Vol. 157, no. 2, pp. 254-257. (In Russ.)]

3. Оганесян Л.П., Мкртчян Г.М., Сукиасян С.Г., Амбарцумян М.К., Аветисян Г.В., Бояджян А.С. Комплемент как патогенный фактор при посттравматическом стрессе // Биологический журнал Армении, 2009. Т. 1, № 61. С. 48-53. [Oganesyan L.P., Mkrtchyan G.M., Sukiasyan S.G., Ambardzumyan M.K., Avetisyan G.V., Boyajyan A.S. Complement as a pathogenic factor in post-traumatic stress]. Biologicheskiy zhurnal Armenii = Biologist. Journal Armenia, 2009, Vol. 1, no. 61, pp. 48-53. (In Russ.)]

4. Романов С.В., Козлов Л.В., Дьяков В.Л., Баталова Т.Н., Гузова В.А. Определение активности протеиназ системы комплемента иммуноферментными методами // Биомедицинская химия, 2003. Т. 49, № 6. С. 604-612. [Romanov S.C., Kozlov L.V., Dyakov V.L., Batalova T.N., Guzova B.A. Determination of the activity of proteases of the complement system immunoassay methods]. Biomeditsinskaja himiya = Biomedical Chemistry, 2003, Vol. 49, no. 6, pp. 604-612. (In Russ.)]

5. Bellander B.M., Singhrao S.K., Ohlsson M., Mattsson P., Svensson M. Complement activation in the human brain after traumatic head injury. J. Neurotrauma. 2001, Vol. 18, no. 12, pp. 1295-1311.

6. Ducruet A.F., Zacharia B.E., Sosunov S.A., Gigante P.R., Yeh M.L., Gorski J.W., Otten M.L., Hwang R.Y., DeRosa P.A., Hickman Z.L., Sergot P., Connolly E.S.Jr. Complement Inhibition Promotes Endogenous Neurogenesis and Sustained Anti-Inflammatory Neuroprotection following Reperfused Stroke. PLoS ONE, 2012, Vol. 7, no. 6, p. e38664.

7. Hillmen P. The role of complement inhibition in PNH. American Society of Hematology, 2008, Vol. 1, pp. 116-123.

8. Ingram G., Loveless S., Howell O.W., Hakobyan S., Dancey B., Harris C.L., Robertson N.P., Neal J.W., Morgan B.P. Complement activation in multiple sclerosis plaques: an immunohistochemical analysis. Acta Neuropathol. Commun., 2014, Vol. 9, no. 2, p. 53.

9. Loeffler D.A., Camp D.M., Bennett D.A. Plaque complement activation and cognitive loss in Alzheimer’s disease. J. Neuroinflammation 2008, Vol. 11, no. 5, p. 9.

10. Momeni N., Bergquist J., Brudin L., Behnia F., Sivberg B., Joghataei M.T., Persson B.L. A novel blood-based biomarker for detection of autism spectrum disorders. Transl. Psychiatry., 2012, Vol. 13, no. 2, p. e91.

11. Palikhe A., Sinisalo J., Seppänen M., Haario H., Meri S., Valtonen V., Nieminen M.S., Lokki M.L. Serum complement c3/c4 ratio, a novel marker for recurrent cardiovascular events. Am. J. Cardiol., 2007, Vol. 1, no. 99 (7), pp. 890-895.

12. Roos A., Bouwman L.H., van Gijlswijk-Janssen D.J., Faber-Krol M.C., Stahl G.L., Daha M.R., Human IgA activates the complement system via the mannan-binding lectin pathway. J. Immunol.,2001, Vol. 1, no. 167 (5), pp. 2861-2868.

13. Sinclair I.J.B. The Role of Complement in the Immune Reactions of Paramecium aurelia and Tetrahymena pyriformis. Immunology, 1958, Vol. 1, no. 3, pp. 291-299.

14. Song C., Dinan T., Leonard B.E. Changes in immunoglobulin, complement and acute phase protein levels in the depressed patients and normal controls. J. Affect. Disord., 1994, Vol. 30, no. 4, pp. 283-288.

15. Spivak B., Radwan M., Brandon J., Baruch Y., Stawski M., Tyano S., Weizman A. Reduced total complement haemolytic activity in schizophrenic patients. Psychol. Med., 1993, Vol. 23, no. 2, pp. 315-318.